详情

内生真菌可可毛色二孢菌产糖条件优化及其在果实保鲜中的应用

申报人:许文山 申报日期:2024-05-30

基本情况

2024年批次
内生真菌可可毛色二孢菌产糖条件优化及其在果实保鲜中的应用 学生申报
创新训练项目
工学
生物工程类
学生来源于教师科研项目选题
一年期
微生物多糖由于具有安全性高、副作用小、理化特性独特等优点而使其在食品和非食品工业备受关注,尤其在医药领域具有巨大的应用潜力。本项目通过优化五指毛桃内生真菌可可毛色二孢菌株产胞外多糖的发酵条件,提取分离胞外多糖,并将应用于果实的采后保鲜,为基于微生物多糖的果实保鲜剂的开发奠定基础。

主持广西自然科学基金广西科技基地和人才专项各一项,参加国家自然科学基金多项,发表论文20余篇,授权国内发明专利4项,英国专利1

参与项目方案的制定实验过程的指导,为项目提供前期的研究基础和一定的资金支持

校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
许文山 化学与生物工程学院 生物工程 2022 研究方案设计与实施
邓业成 化学与生物工程学院 生物工程 2022 圣女果保鲜试验
陆佳慧 化学与生物工程学院 生物工程 2022 胞外多糖的提取纯化
王研 化学与生物工程学院 生物工程 2022 胞外多糖的发酵条件优化
杨其乐 化学与生物工程学院 生物工程 2023 圣女果保鲜试验

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
李静 化学与生物工程学院

立项依据

通过优化五指毛桃内生真菌可可毛色二孢菌株产胞外多糖的发酵条件,提取分离保外多糖,并将应用于果实的采后保鲜,为可可毛色二孢菌多糖的应用奠定基础。

(1)内生真菌可可毛色二孢菌产胞外多糖发酵条件优化:从碳、氮源及培养基初始pH 、发酵温度、接种量等方面优化可可毛色二孢菌生长和产多糖发酵条件。

2)胞外多糖提取制备:酶法提取,确定酶的种类、浓度、温度、时间等因素对提取率的影响。

  (3)胞外多糖对圣女果的保鲜效果:采用不同浓度的可可毛色二孢菌F6胞外多糖溶液浸泡处理圣女果果实,定期采样测定失重率、硬度、可溶性固形物、可滴定酸、酶类等指标,确定可可毛色二孢菌胞外多糖对圣女果贮藏品质的影响。

多糖是通过糖苷键将多个相同或不同的单糖连接而成的具有极大分子量的化合物。它不仅是生物体重要的能量来源,也参与各种代谢调节,比如免疫调节,信号识别等。与蛋白质,脂类以及核酸一起组成生命体的基本物质,参与机体各项活动和功能。自然界中存在三种来源的多糖,分别为动物,植物以及微生物,因而其分布相当广泛,几乎存在于所有的生命体中。一直以来,来源于植物多糖的多种生物活性被相继发现并应用在生产生活各个方面,然而,由于植物生长缓慢,多糖提取过程繁琐等原因,已经不能满足市场需求。来源于微生物的多糖即微生物多糖被证明有多种生物功能和生物活性,比如抗氧化活性,抑菌活性等,且微生物容易培养,生长周期短,不受气候,地理因素的制约和影响,可在人工条件下快速获得大量多糖,提取方法简单,产物安全无毒,具有较好的组织相容性,而备受研究者青睐。其产物作为增稠剂,甜味剂,食品添加剂,稳定剂等在食品,化工,医药等方面已有广泛应用,因此,与来源于动物和植物的多糖相比,来源于微生物的多糖具有更好的应用能力和更广的发展前景。

目前,去除微生物粗多糖溶液中的蛋白主要为以下几种常见的方法:Sevag 法、三氯乙酸法、蛋白酶法。Sevag 法可使粗多糖溶液中的蛋白在有机溶剂中发生变性,形成胶状物,经离心后可除去,Wang 等在巨大芽孢杆菌 TF10 的粗胞外多糖溶液中加入Sevag 试剂,剧烈震荡后离心,保留水相溶液,多次重复以上步骤,直至水相和有机相之间无蛋白质层,成功去除了分子量较低的聚合物和游离蛋白质。Sevag 法虽然条件温和,但效率较低,需要经过多次重复,而且会造成有毒溶剂的残留,对后续的实验产生一定的影响。在发酵上清液中加入一种强酸(三氯乙酸),通过破化蛋白质空间结构,使蛋白变性后离心去除,芦红云等使用 3%的三氯乙酸与灰树花胞外粗多糖溶液等体积混合,4 ℃条件下搅拌 10 min,离心后收集上层水相,继续用此方法多次重复,最终得到不含蛋白质的多糖溶液。三氯乙酸法虽然效率高,但同时会伴随多糖链的水解,造成多糖组分发生变化,以及多糖损失。酶法中一般复合酶较为常见,如蛋白酶、果胶酶、纤维素酶等,隋志方等利用复合酶提取胞外多糖,通过添加 3%的复合酶(纤维素酶∶木瓜蛋白酶=1:1,质量比),酶解 50 min,温度 50℃,pH 值 6.5 时,黑木耳多糖得率为 9.26%,酶提取法具有条件温和、杂质易除、回收率高等特点,具有广阔的发展前景。目前,有部分研究者先利用 Sevag 法分离多糖溶液中的蛋白,再利用酶法进一步去除蛋白,相较于单一的方法去除蛋白,具有更好的效果。

部分胞外多糖经除蛋白后仍含有大量色素,影响成品的质量以及后续活性研究,因此粗多糖必须进行脱色,多糖脱色常常采用吸附法、氧化法、离子交换法。张达成等利用吸附法对银耳多糖脱色工艺进行了研究,发现利用活性炭进行脱色时,脱色率为 87.6%,多糖保留率为 83.1%。彭期定等采用 30% H2O2对木蹄层孔菌胞外多糖脱色,用量为粗多糖溶液体积的 1/10(V/V),虽然效果较为显著,但是化学法会破坏多糖的活性及其结构。芦红云等使用离子交换法吸附色素。物理脱色效果相较于化学法较弱,需要多次重复脱色,但吸附材料可经过回收处理再利用,不仅降低材料成本,而且对多糖结构和活性影响最小,具有更广阔的应用前景。纯多糖需要粗多糖通过层析柱进一步分离纯化制得。李辉等采用凝胶柱(Sepharose CL-6B)纯化双歧杆菌 RH 胞外多糖,通过收集多糖洗脱液,冷冻干燥后得胞外多糖纯品;曹永强等依次采用 DEAE-Sepharose FastFiow 离子交换柱层析,Sepharose CL-6B 凝胶柱层析纯化,制得植物乳杆菌粗多糖纯品。

微生物胞外多糖来源广泛,具有不同的功能特性,多糖产量的提高,仍是当前该研究领域的前提和关键。通过优化培养基组成及发酵参数可以进一步提高微生物多糖的产量,培养基中组成成分的差异和培养条件的不同都会影响微生物的生长,从而影响微生物多糖的产量,选择合适的培养基组成、培养条件,可以显著提高微生物多糖的产量。目前,液态发酵法被广泛用于提高微生物胞外多糖的产量,杨静等通过采用 BoxBehnken 响应面法实验优化胞外多糖产量,分析得到最佳发酵工艺,使多糖的产量提高了 133.3%。Sathishkumar 等利用内共生细菌枯草芽孢杆菌 MKU SERB2,通过使用响应面法优化胞外多糖的生产,最优条件为 11.5 g/L 蔗糖、3.5 g/L 酵母提取物、3.0 g/L蛋白胨和 2.5 g/L 氯化钙下,胞外多糖产量得到显著提高,产量为 617.81 μg/mL。微生物多糖产量的提高,更易使活性多糖被开发利用,进入产业化和商业化阶段。

目前已被开发的有黄单胞杆菌产生的黄原胶, 出芽短梗霉产生的普鲁兰多糖、果聚糖,酵母等菌产生的葡聚糖等。食品保鲜是降低食品损耗的重要技术,多糖在食品保鲜领域的应用已有不少报道, 如黄原胶和普鲁兰多糖,但普鲁兰多糖等成本高, 这使其在食品领域的应用受到限制。寻找新的更有应用前景的多糖, 研究并拓展其应用领域和工艺仍具有重要意义。

参考文献

[1] Barcelos M, Vespermann K, Pelissari F M, et al. 微生物胞外多糖的生物技术生产现状及应用[J].食品科学与营养评论, 2019, 60(40): 1-21

[2] 王志军, 谭志军, 张庆妍, 赵柔, 等. 一种多糖产菌菌株的筛选与鉴定及其发酵条件优化[J].农业科技, 2023, 24 (03): 54-62.

[3] 王玲玲, 王玲芳, 石琦玲, 等. 巨型芽孢杆菌TF10关键胞外多糖成分的纯化及分子量分布[J].环境科学学报, 2018, 63: 9-15.

[4] 毕士媛.枫香拟茎点霉菌NJUSTb1胞外多糖的结构鉴定、化学修饰及活性研究[D]. 南京理工大学, 2019.

[5] 常海霞李明源 麦日艳古·亚生 . 产胞外多糖多功能促生菌的筛选鉴定及促生评价[J]. 生物技术通报, 2024, 40 (03): 273-285.

[6] 丁莉.一株细菌胞外多糖的分离纯化及其抗氧化活性研究[D]. 西北大学, 2021.

[7] 窦富超.地衣芽孢杆菌SN02004-01产胞外多糖发酵条件优化及降血糖活性研究

[8] 黄晓宇韩瑨高雅茹. 植物乳杆菌胞外多糖的研究进展 [J/OL]. 食品与发酵工业, 1-10[2024-05-25].

[9] 姬淑洁杨传佳陈修来. 新鞘氨醇杆菌胞外多糖的发酵优化及结构和性质表征 [J/OL]. 食品与发酵工业, 1-13[2024-05-25].

[10] 贾倩英朱环李宜娟等. 桃色欧文氏菌Cp2胞外多糖测定方法及培养条件的优化[J]. 草原与草坪, 2024, 44 (01): 138-149.

[11] 邝嘉华.解淀粉芽孢杆菌DMBA-K4胞外多糖发酵、结构解析和缓解小鼠溃疡性结肠炎探究[D]. 华南理工大学, 2021.

[12] 李春雨屈建航周佳.Rufibacter hautae NBS58-1胞外多糖的抗氧化活性及其在草莓保鲜中的应用[J]. 河南工业大学学报自然科学版), 2023, 44 (05): 93-99

[13] 龙丹丹叶淑红燕欣悦. 黄褐假单胞菌Y_(11)产胞外多糖发酵条件优化及其抗氧化活性研究 中国酿造, 2024, 43 (04): 115-122.

[14] 马博文周佳赵帅. 副球菌TH21-44胞外多糖的发酵条件优化及其乳化性能[J]. 食品研究与开发, 2023, 44 (24): 1-8+15.

[15] 宋鹏炜孙畅丁强. 裂褶菌高产胞外多糖发酵培养基优化及生物活性研究[J]. 饲料研究, 2023, 46 (22): 86-91.

[16] 谭凤翔余元善温靖. 乳酸菌胞外多糖的合成、生物活性及应用研究进展[J]. 中国酿造, 2023, 42 (09): 7-13.

[17] 王蓓蓓张伟周晓伦. 微生物胞外多糖的提取与应用研究进展 安徽农学通报, 2021, 27 (18): 21-23.

[18] 杨棒棒.Rufibacter sediminis H-1胞外多糖的制备、结构表征及其生物活性研究[D]. 河南工业大学, 2022.

[19] 杨立军花娇娇崔晨旭. 一株高产胞外多糖半夏内生真菌的鉴定、发酵条件优化及生物活性测定[J]. 中国酿造, 2023, 42 (11): 109-114.

[20] 于文娜于连升王烁. 乳酸片球菌J1产胞外多糖发酵条件优化[J]. 中国农学通报, 2024, 40 (06): 143-151.

[21] 张钊瑞 张晨李大鹏. 微生物多糖的结构与应用研究进展[J]. 食品研究与开发, 2021, 42(1): 182\u2012192.

[22] 赵婧高永娇孙靖辰. 乳酸菌胞外多糖的研究进展[J]. 黑龙江八一农垦大学学报, 2023, 35 (05): 51-56+105.

[23] 周渤森曹慧莹齐心彤. 植物乳杆菌HDL-03胞外多糖合成条件的优化研究 中国农学通报, 2024, 40 (11): 14-21.

本项目从五指毛桃植株上分离得到一株产胞外多糖真菌, 前期研究发现其培养过程中可代谢出大量胞外多糖。基于此,本研究优化其产多糖的发酵条件,并考查其胞外多糖在圣女果保鲜中的应用效果, 为多糖保鲜功能的开发利用奠定基础, 也为该菌多糖应用领域的拓展提供理论参考。

1、技术路线夏日笔记-IMG

2、待解决问题

1)确定可可毛色二孢菌产胞外多糖最好发酵条件

2)确定可可毛色二孢菌产胞外多糖圣女果的保鲜效果。

3、预期成果

1)制定一套五指毛桃内生真菌可可毛色二孢菌产胞外多糖的发酵可提取工艺工艺,并确定该胞外多糖对圣女果的保鲜效果,为其应用奠定理论基础。

2)撰写论文1篇或专利1项。

12024年5月至2024年9月:确定研究方案,并完成产胞外多糖发酵条件的优化和数据整理。

2、2024年10月至2024年11月:完成胞外多糖提取分离条件的优化和数据整理。

3、202412月至20253月:完成圣女果保鲜试验和数据整理。

4、2025年4月:完成项目结题报告,撰写论文或专利。

1、与本项目有关的研究积累和已取得的成绩

已完成五指毛桃内生真菌可可毛色二孢菌的分离鉴定


2、已具备的条件,尚缺少的条件及解决方法

已具备的条件:项目团队成员稳定,具有一定的菌株培养实验技术,项目所用设备生物工程实验室已具备。

   尚缺少的条件及解决方法:资金短缺,一方面通过申请项目经费支持,另一方面由导师或学院支持。

经费预算

开支科目 预算经费(元) 主要用途 阶段下达经费计划(元)
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 8000.00 3000.00 5000.00
1. 业务费 5000.00 1000.00 4000.00
(1)计算、分析、测试费 1500.00 700.00 800.00
(2)能源动力费 0.00 0.00 0.00
(3)会议、差旅费 0.00 0.00 0.00
(4)文献检索费 500.00 文献查阅 300.00 200.00
(5)论文出版费 3000.00 论文发表 0.00 3000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 0.00 0.00
4. 材料费 3000.00 试剂耗材 2000.00 1000.00
结束