基于天然黑色素/羟丙基壳聚糖水凝胶的制备及抗菌性能研究

慢性伤口被认为是全世界的主要医疗保健问题之一。常见的慢性伤口如糖尿病足溃疡、褥疮、静脉溃疡和手术部位感染等，伤口愈合过程往往会出现愈合慢或难愈合的情况，从而可能导致细菌感染或疼痛，严重甚至需要截肢或出现败血症等严重并发症。细菌感染是伤口愈合的最大障碍之一，细菌的存在会导致严重的组织损伤、长时间的炎症反应和延迟伤口愈合。在临床上，经常使用抗生素来预防伤口感染。然而，它们的不当或过度使用导致了多重耐药菌株的出现，从而导致持续的慢性伤口。为了应对耐药细菌引起的感染，开发新颖有效的抗菌方案来解决细菌感染问题变得至关重要。

据报道，光热治疗（PTT）是一种通过光热试剂在近红外光激光照射下将光能转换为热能从而使局部产生高温来消融细菌，治疗过程还能防止细菌产生耐药性，且无需过度去除健康组织即可达到对抗感染的目的治疗方法。因此，PTT 被理解为一种安全有效并在未来有望成为替代抗生素药物治疗的抗菌策略，从而在近年来引起了人们的广泛关注。然而，单一的PTT面临温度过低无法完全杀死细菌或者高温容易损害周围正常皮肤组织，从而导致在一定程度上限制其使用范围。因此，为了克服这些限制，研究人员开发通常将PTT 与其它治疗手段相结合从而增强抗菌治疗，以达到预期的治疗效果并减少治疗过程的副作用。

黑色素作为一种天然黑色素广泛分布于许多生物体中，如从墨鱼墨囊中提取出的黑色素纳米粒子（CMP），具有丰富的黑色素成分使其具有优异的光热特性。此外，从生物体中提取的天然黑色素纳米颗粒比合成黑色素纳米颗粒具有更好的生物相容性和生物降解性，可以减轻生物系统中的安全性和新陈代谢问题。CMP 表面还具有一定的儿茶酚结构，这不仅赋予了它们高性能的组织粘附性能，而且还可以通过分子间氢键和π-π堆叠方式来负载其它材料。盐酸小檗碱 （BH） 是一种天然异喹啉生物碱，从各种草药（如黄连、小檗）中提取，具有一系列药理特性，包括抗菌、抗炎、抗氧化以及调节脂质代谢功能，已被广泛应用于临床治疗。盐酸小檗碱具有两亲性离域正电荷结构和异喹啉结构，使其具有与其它材料进行静电相互作用和 π-π 堆叠自组装的能力。且微生物表面的脂质层是带负电的，因此BH还具有选择性积累到微生物细胞表面的能力。

由三维多孔网络组成的水凝胶，表现出良好的组织相容性、组织粘附性以及良好的保湿性从而促进伤口恢复，因此其在伤口愈合领域具有广泛的应用前景。此外，水凝胶由于其具有多孔结构赋予了可负载其他物质的功能，常见的可用在药物递送领域中，通过负载许多如生物活性分子、抗菌肽或纳米颗粒。这些负载的药物可以在精确的时间下控制药量递送到伤口部位，并可在最大限度地提高治疗效果和加速伤口愈合方面发挥重要作用。近来有研究证明基于水凝胶的光热治疗相对于广泛报道的基于纳米试剂的光热治疗具有更好的治疗效果和临床潜力。

本项目拟设计将墨鱼墨囊中提取出的CMP通过静电相互作用和 π-π 堆叠进行负载盐酸小檗碱得到CMP-BH纳米粒子，并将其负载在DCNC-HPCS凝胶网络中，构建DCNC-HPCS@CMP-BH多功能抗菌水凝胶。BH作为抗菌化疗药物，CMP由于其出色的光热性能而被用作光热试剂。此外，CMP还具有类似于贻贝蛋白的儿茶酚结构从而可以进一步增强水凝胶的组织粘附性能，同时赋予水凝胶良好的抗氧化和自愈特性。系统研究DCNC-HPCS@CMP-BH水凝胶的光热转换效率、NIR 光控药物释放以及联合光热/化疗多功能抗菌应用（图 1）。1. CMP-BH纳米粒子的制备

从市场中新鲜墨鱼解剖的墨囊采用差速离心分离法分离出CMP，CMP通过静电相互作用和 π-π 堆叠进行自组装负载盐酸小檗碱得到CMP-BH纳米粒子，内容如下：

（1）表征CMP、CMP-BH结构、形貌和粒径分布；

（2）考察CMP对比合成黑色素的光热性能差异；

（3）考察CMP-BH中BH的负载量。

 

1. CMP-BH纳米粒子的制备

从市场中新鲜墨鱼解剖的墨囊采用差速离心分离法分离出CMP，CMP通过静电相互作用和 π-π 堆叠进行自组装负载盐酸小檗碱得到CMP-BH纳米粒子，内容如下：

（1）表征CMP、CMP-BH结构、形貌和粒径分布；

（2）考察CMP对比合成黑色素的光热性能差异；

（3）考察CMP-BH中BH的负载量。

3. DCNC-HPCS凝胶骨架的合成

通过高碘酸钠氧化剑麻纤维素纳米晶（CNC）合成醛基化纤维素（DCNC），DCNC上的-CHO在室温下与羟丙基壳聚糖（HPCS）的-NH2通过席夫碱反应制得生物相容性和机械性能良好的DCNC-HPCS水凝胶。

（1）考察不同DCNC含量对DCNC-HPCS凝胶机械性能的影响；

（2）考察CNC醛基化程度对水凝胶的成胶强度的影响；

（3）考察温度对DCNC-HPCS水凝胶成胶的影响。

 

1. 天然多糖基水凝胶研究现状及动态

多糖是与糖苷键相连的碳水化合物分子的长链，天然多糖在自然界中分布广泛，一些天然聚合物还具有抗菌的特性[1, 2]。因此，多糖聚合物如明胶、普鲁兰多糖和壳聚糖等生物高分子材料已被广泛用于制备伤口敷料，由于其无毒、抗菌、生物相容、止血和非免疫原性等特性，在生物医学领域得到极大的应用。大多数这些聚合物以泡沫、薄膜、海绵和纤维的形式用于药物载体装置、皮肤组织支架和伤口敷料中。目前，使用天然聚合物合成水凝胶伤口敷料时，高保水能力使其成为制备伤口敷料的最佳选择，它们在伤口中提供潮湿环境并去除多余的伤口液体，从而加速伤口愈合[3]。

纤维素是地球上最丰富的天然聚合物。纤维素存在于植物中，大约15-30%在原细胞壁中，超过40%在次级细胞壁中。次生细胞壁是最厚的层，对植物的机械性能也是最重要的[4]。天然来源的纤维素具有可回收性、可调表面特性、毒性风险小、生物降解性、生物相容性[5]。纤维素基水凝胶在除了生物医学领域最常见外，还包括生物传感和水净化。常见纳米纤维的三种类型，即细菌纳米纤维素，纤维素纳米晶和纤维素纳米纤维。细菌纳米纤维素用于抗菌伤口愈合，可以安全有效地改善伤口愈合。纤维素纳米晶是具有可调表面化学性质的优良生物材料。最近，一些研究集中在纤维素纳米晶体通过酯化[6]、氧化[7]、氨基甲酸酯[8]、酰胺化[9]、醚化[10]的改性上。高碘酸盐的氧化导致纤维素碳原子上的C2和C3碳键裂解和醛官能团的形成，因此，二醛纤维素纳米晶可以与壳聚糖及其衍生物或明胶中的游离氨基发生反应，这种类型的反应被称为席夫碱反应[11]。水凝胶是一种交联聚合物网络，具有很高的保水能力，广泛应用于生物医学领域。由于增加的柔韧性和缠结倾向，CNF有利于形成机械稳定的水凝胶，CNC水凝胶易于降解，膨胀率过高和机械不稳定。在生物医学工程的情况下，膨胀和脱胀动力学以及可控的降解是细胞生长和组织再生的主要因素[5]。

壳聚糖是一种天然多糖，主要来源于昆虫（角质层）和甲壳类动物（如蟹、虾和龙虾等）[12]。天然多糖甲壳素经过部分脱乙酰化以提供壳聚糖，壳聚糖是最常用的大分子之一[13, 14]。除了抗菌特性外，它还具有可生物降解和生物相容性[13]。然而，由于壳聚糖的水溶性差，壳聚糖的应用在一定程度上受到限制。羟丙基壳聚糖（羟丙基脱乙酰壳聚糖，HPCS）通过引入一定量的羟丙基来提高壳聚糖在水中的溶解度。与壳聚糖相比，它具有更好的吸湿性、保水性以及交联性能[15]。这些特性使羟丙基壳聚糖成为理想的止血材料，并有望作为伤口愈合促进剂。为制备生物基材料并赋予其实用性能，将包括木聚糖，纤维素和壳聚糖在内的一些多糖改性以期一方面可以保留纤维素基水凝胶的原本的优良特性, 另一方面可以赋予其本身所不具备的优点, 以拓宽其应用价值。

Qiu[16]等人以聚乙烯醇和羟丙基壳聚糖为底物制备了双交联网络水凝胶，使用 HPCS 和 PVA 作为底物来制造水凝胶，并使用硼砂和 OSA 作为交联剂，具有动态亚胺和硼酸盐键合双交联网络的水凝胶是通过简单的混合方法制备的，该双交联网络使水凝胶具有出色的自修复和机械性能，对药物体外释放速率、生物毒性以及水凝胶的抗菌和降解特性进行评估，发现其具有潜在的医疗应用价值。Liu[17]等人通过基于丝素蛋白肽接枝羟丙基壳聚糖 （HPCS-g-SFP） 和氧化微晶纤维素 （OMCC） 通过席夫碱键开发了一种可注射HMSC水凝胶，HPCS-g-SFP 共聚物对氢羟基自由基和 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基 （DPPH） 表现出高效的自由基清除能力，并将四甲基吡嗪 （TMP） 封装到 HMSC 水凝胶中，得到负载 TMP 的 HMSC 水凝胶，负载 TMP 的 HMSC 水凝胶具有能保留95%细胞活性并可促进伤口快速愈合，同时防止疤痕形成，具有促进无疤痕伤口愈合的潜力。Peng[18]等人希夫碱反应以及羟丙基壳聚糖 （HCS）、ε-聚-l-赖氨酸 （EPL） 和 2,3,4-三羟基苯甲醛 （TBA） 之间的氢键，以及Fe3+和邻苯三酚之间可逆配位形成的多重交联，通过一锅法成功制备了一系列可注射复合水凝胶，并该水凝胶表现出优异的物理化学特性，包括注射性、自愈性、保水性和粘附性，能够长时间填充不规则的伤口，为伤口愈合提供合适的潮湿环境，该水凝胶还具有优异的止血性能可以快速止血，避免急性创伤中大量失血的严重后遗症，该简单的合成多功能注射止血抗菌水凝胶可以在未愈合、感染伤口的生理环境中杀死细菌并促进愈合，并用于临床治疗的潜力。Liu[19]等人通过乙酰乙酸纤维素 （CAA）、羟丙基壳聚糖 （HPCS） 和氨基改性纤维素纳米晶体制备了一种具有 pH 响应特性和优异的稳定性水凝胶，在酸性条件下通过烯胺键交换表现出自修复行为，此外，对成纤维细胞 L929 细胞的 CCK-8 细胞毒性研究表明 CNC 增强水凝胶具有良好的生物相容性，结果表明，该CNC 增强注射和自修复水凝胶在生物医学领域具有巨大的应用潜力。

2. 天然黑色素纳米粒光热治疗研究现状及动态

黑色素类生物聚合物广泛存在于皮肤、头发、眼睛虹膜、脑髓质等人体组织和器官中，广泛应用于诊断、生物传感器和组织工程等生物医学领域，表明它们具有良好的生物相容性[20, 21]。其中，从墨鱼墨囊中提取的黑色素纳米颗粒（CMP）具有丰富的黑色素成分从而具有优异的光热特性，已用于肿瘤治疗和活性氧清除[22]。CMP的表面具有一定的儿茶酚结构，这不仅赋予了它们高性能的组织粘附性能，而且还允许它们通过分子间氢键与其他材料络合[23]。此外，CMP表面有丰富的芳香环，可以通过π-π堆积或氢键结合在其表面负载化学药物，从而赋予CMP负载药物的能力。

Fan [24]等人合成了水溶性黑色素纳米颗粒，并通过黑色素与索拉非尼芳香族结构之间的强结合相互作用将索拉非尼负载在其表面，开发了一种基于黑色素的治疗诊断学平台，用于黑色素瘤和肿瘤药物递送的多模态成像。由于天然的黑色中含有具有丰富胺基[25]，Zhang[26]等人通过血卟啉的羧基与黑色素纳米颗粒的胺基反应制备了血卟啉-黑色素纳米偶联物 （HMNCs），生物启发的 HMNC 能够实现高生物相容性、US 触发的声动力学疗法（SDT）和 NIR 激光诱导的 PTT，与单独使用 SDT 或 PTT 相比，联合 SDT-PTT 在体外对癌细胞的治疗效果要高得多，通过小鼠静脉注射 HMNCs 实验发现，HMNCs 可以在肿瘤区域内积累，为肿瘤光声 （PA） 和热成像提供高对比度，并与单独使用 SDT 或 PTT 相比，通过协同 SDT-PTT 高度抑制肿瘤生长，同时未观察到明显的副作用，表明该受生物启发的 HMNC 可以作为肿瘤治疗诊断学的优秀 SDT-PTT 纳米制剂。Li[27]等人基于己二酰肼改性透明质酸、苯甲醛基团功能化聚乙二醇）-共聚（癸二酸甘油酯）和墨鱼黑色素纳米颗粒开发了一种可注射胶粘剂自修复光热双动态席夫碱网络水凝胶，它具有优秀的组织粘附性、拉伸性和自愈特性，使它们能够适应运动伤口的频繁运动，该胶粘剂自修复光热水凝胶可以适应运动伤口的频繁运动，并且可以改善感染并促进正常和感染运动伤口的愈合，这表明它们在临床运动伤口治疗中具有巨大潜力。Caldas[28]等人通过天然黑色素纳米颗粒（MNP）负载阿霉素（DOX）制成的新型药物递送纳米平台，在不使用无毒溶剂的情况下具有 99% 的阿霉素 （Dox） 掺入效率，48小时后，在光热刺激下观察到约 23% 的药物持续释放，而在没有刺激的情况下为 15%，并且当将载有 Dox （Dox-MNP） 的天然 MNP 与 SaOs-2 细胞接触并同时接受 NIR 光时，观察到癌细胞在 48 小时内减少了 93%，表明了化疗和光疗之间的协同效果，这是首次从棕褐色中提取的天然 MNP 作为化疗光热剂在骨肉瘤细胞系上进行测试，表明这些 NP 是一种有效、经济高效、可重复、无毒的纳米平台，有潜力用于化疗和光热协同治疗骨肉瘤，促进靶向递送、高局部浓度和降低全身毒性。

参考文献

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1. 剑麻纤维是广西地区的特色生物质资源，同时凭借着纯天然，绿色环保的优势受到越来越多人的关注。党的十八大以来，习近平总书记多次强调加强可持续绿色生态文明建设，加快调整优化产业结构、能源结构，倡导绿色低碳的生产生活方式。基于此，本次项目就地取材，以广西海产墨鱼资源墨囊提取黑色素纳米粒，以及广西地区丰富的剑麻纤维和绿色高分子材料羟丙基壳聚糖为凝胶骨架，利用醛基修饰，构筑席夫碱动态交联水凝胶。探究席夫碱键交联对凝胶理化性能的影响规律，揭示交联的凝胶化机制。系统评估凝胶可注射性、生物相容性、体内生物可降解性等综合性能。

2. 本项目拟设计天然黑色素负载盐酸小檗碱得到的CMP-BH纳米粒子，并将其负载在凝胶网络中，构建DCNC-HPCS@CMP-BH多功能抗菌水凝胶。

3． CMP由于其出色的光热性能而被用作光热试剂。更重要的是，CMP具有类似于贻贝蛋白的儿茶酚结构从而赋予其活性氧清除以及粘附性能。可用于研究基于骨架凝胶的光热、清除羟自由基产生效率、可注射性和自愈合等特性以及联合光热/化学动力学治疗多功能抗菌应用。 

1. 墨鱼黑色素纳米粒（CMP）提取及性能研究

采用简单的差压离心法从新鲜墨鱼的解剖墨囊中分离CMP。将含CMP的溶液以 2000 r/min 离心 5 min 以去除大沉淀，然后在 4 °C 下以 12 000 r/min 离心 10 min，得到CMP。最后，用去离子水洗涤 CINP 数次，并悬浮在去离子水中以供进一步使用。通过UV-vis、 FT-IR、DLS、SEM等对CMP的结构及形貌进行表征。

2. CMP-BH的制备

对于CMP载药BH，先使用超声处理器将 5 mg CMP 分散在 4.5 mL 蒸馏水中 1 分钟。然后将 1 mg BH溶解到 0.5 mL蒸馏水中。将CMP分散液加到药物溶液中，并在室温下搅拌过夜。然后用蒸馏水在室温下以 10000 rpm 离心洗涤3 次，并保留上清液以备进一步分析。将最终溶液保存在 4°C 以备进一步使用。

3. DCNC-CS凝胶骨架的合成

通过高碘酸钠氧化剑麻微晶纤维素（CNC）合成醛基化纤维素（DCNC），DCNC上的-CHO在室温下与羟丙基壳聚糖（HPCS）的-NH2通过席夫碱反应制得生物相容性和机械性能良好的DCNC-HPCS水凝胶。

4. DCNC-HPCS@CMP-BH水凝胶制备及性能研究

将CMP-BH纳米粒子掺杂至DCNC-HPCS水凝胶中制备DCNC-HPCS@CMP-BH水凝胶。

革兰氏阳性金黄色葡萄球菌在LB肉汤中在37 ℃下以150 rpm的转速培养过夜，直到细菌浓度达到1.0×108 CFU mL-1。然后，在48孔培养板中加入金黄色葡萄球菌(1×108 CFU mL-1)和胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)。然后，在37 ℃下不摇动培养48 h，每隔24 h更换一次新鲜培养基。最后，除去TSB培养基，用无菌PBS洗去未附着的细菌3次，得到附着在48孔板上。水凝胶与细菌共孵育。通过标准平板计数法和结晶紫染色后测定所得溶液在595 nm处的吸光度来量化细菌的生物量。初步评估水凝胶的抗菌性能。

拟解决的问题：天然黑色素纳米粒子通过表面π-π堆积或氢键结合负载盐酸小檗碱，并将其负载在凝胶网络中，构建DCNC-HPCS@CMP-BH水凝胶，从而实现光热治疗与化疗的互补效果，提高抗菌效果，减少副作用。

预期成果：本项目具有一定的应用价值，可制备一种能够负载光热试剂和药物的自愈合、生物相容性、机械性能良好的水凝胶，同时为光热治疗协同化疗提供一种新的研究方法和思路。预计发表学术论文1篇，并提交结题报告1份。 

1. 墨鱼黑色素纳米粒（CMP）提取及性能研究

采用简单的差压离心法从新鲜墨鱼的解剖墨囊中分离CMP。将含CMP的溶液以 2000 r/min 离心 5 min 以去除大沉淀，然后在 4 °C 下以 12 000 r/min 离心 10 min，得到CMP。最后，用去离子水洗涤 CINP 数次，并悬浮在去离子水中以供进一步使用。通过UV-vis、 FT-IR、DLS、SEM等对CMP的结构及形貌进行表征。

2. CMP-BH的制备

对于CMP载药BH，先使用超声处理器将 5 mg CMP 分散在 4.5 mL 蒸馏水中 1 分钟。然后将 1 mg BH溶解到 0.5 mL蒸馏水中。将CMP分散液加到药物溶液中，并在室温下搅拌过夜。然后用蒸馏水在室温下以 10000 rpm 离心洗涤3 次，并保留上清液以备进一步分析。将最终溶液保存在 4°C 以备进一步使用。

3. DCNC-CS凝胶骨架的合成

通过高碘酸钠氧化剑麻微晶纤维素（CNC）合成醛基化纤维素（DCNC），DCNC上的-CHO在室温下与羟丙基壳聚糖（HPCS）的-NH2通过席夫碱反应制得生物相容性和机械性能良好的DCNC-HPCS水凝胶。

4. DCNC-HPCS@CMP-BH水凝胶制备及性能研究

将CMP-BH纳米粒子掺杂至DCNC-HPCS水凝胶中制备DCNC-HPCS@CMP-BH水凝胶。

革兰氏阳性金黄色葡萄球菌在LB肉汤中在37 ℃下以150 rpm的转速培养过夜，直到细菌浓度达到1.0×108 CFU mL-1。然后，在48孔培养板中加入金黄色葡萄球菌(1×108 CFU mL-1)和胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)。然后，在37 ℃下不摇动培养48 h，每隔24 h更换一次新鲜培养基。最后，除去TSB培养基，用无菌PBS洗去未附着的细菌3次，得到附着在48孔板上。水凝胶与细菌共孵育。通过标准平板计数法和结晶紫染色后测定所得溶液在595 nm处的吸光度来量化细菌的生物量。初步评估水凝胶的抗菌性能。

拟解决的问题：天然黑色素纳米粒子通过表面π-π堆积或氢键结合负载盐酸小檗碱，并将其负载在凝胶网络中，构建DCNC-HPCS@CMP-BH水凝胶，从而实现光热治疗与化疗的互补效果，提高抗菌效果，减少副作用。

预期成果：本项目具有一定的应用价值，可制备一种能够负载光热试剂和药物的自愈合、生物相容性、机械性能良好的水凝胶，同时为光热治疗协同化疗提供一种新的研究方法和思路。预计发表学术论文1篇，并提交结题报告1份。