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红糟酸中发酵菌株的分离鉴定及发酵条件研究

申报人：张文静 申报日期：2025-05-26

基本情况

2025年批次
红糟酸中发酵菌株的分离鉴定及发酵条件研究 学生申报
创新训练项目
工学
生物工程类
学生自主选题
一年期
红糟酸是广西一种风味独特的佐餐佳品，主要集中在广西的武宣、桂平等地制作，是当地有名的土特产，因其发酵后酒糟红色味酸，食用后回味无穷而闻名。目前产品属于自然发酵，这不利于红糟酸产品质量控制，极大地制约了红糟酸产品的开发和市场推广。因此，本项目以红糟酸为研究对象，对其中的发酵菌株进行分离纯化并鉴定确定红糟酸中发酵的优势菌种，通过菌株的形态特征、生理生化特征和 16S rRNA分子序列分析等方法进行菌株鉴定，并对菌株的培养条件进行优化，确定红糟酸产品生产的最佳工艺参数，为红糟酸产品的工业化应用提供理论依据。
参与桂林理工大学2023年大学生创新创业训练计划项目《百香果果壳发酵型果酒产品》
参与桂林理工大学2024年大学生创新创业训练计划项目《甘蔗发酵液中产纤维素菌株的分离筛选及鉴定》 
主持广西重点研发计划项目（桂科AB24010183）：粉圆新型防腐技术及免煮工艺研究与产业化，55万元，2024.5-2027.5
主持桂林万禾农产品有限公司合作项目：百香果壳发酵果酒生产中降低甲醇含量的工艺研究，10万元，2021.1-2023.12
主持广西植物功能物质研究与利用重点实验室开放基金（FPRU2016-10）《三种特色念珠藻中藻蓝蛋白的结构比较和抗氧化性功能评价》2017
 
指导教师提供实验材料和仪器，对试验方案进行修改和审核，对实验过程进行技术指导。
校级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
张文静 化学与生物工程学院 生物工程 2023 负责统筹工作
邢仙 化学与生物工程学院 化学工程与工艺 2023 菌株条件培养优化
杨钊 化学与生物工程学院 生物工程 2023 菌种保存
廖金凤 化学与生物工程学院 化学工程与工艺 2023 菌种分离提纯
李安琪 化学与生物工程学院 生物工程 2023 菌种筛选鉴定

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
张会香 化学与生物工程学院 否

立项依据

红糟酸（Red vinasse acid）是广西盛传的一种风味独特的发酵食品，是利用红曲霉菌发酵蒸熟后的大米辅以适合腌渍的蔬菜瓜豆制成的。其颜色鲜艳、酸甜适口，可谓是色、香、味俱全，而且红糟还可以促消化，具有一定保健作用，深受当地人民的喜爱。红糟酸不仅色鲜味浓，而且具有对人体有益的功效，例如软化血管、帮助消化、增加食欲等，是一种老少皆宜的食品。红糟酸中复杂的微生物代谢活动使其风味独特、色泽鲜红，也因此在中式厨房中常被用于烹制肉类和蔬菜等。然而，目前红糟酸生产模式主要为家庭手工制作或小作坊生产，用于发酵的红曲霉产色素能力良莠不齐，制作工艺亦不规范，这导致发酵成品中微生物组成情况不明，产品安全没有保障。
因此，研究红糟酸中微生物组成结构，筛选高产色素红曲霉并优化发酵工艺，不仅有助于稳定红糟酸的品质，也对推动红糟酸的工业化生产具有重要意义。通过优化菌种可以确保红糟酸产品质量和安全，同时对宣扬广西地域传统特色美食文化、构建地方特色产品产业经济链、促进提升产品品牌效益、扩大红糟酸知名度以及推进广西特色产品经济发展有着重要的意义。 
1、红糟酸中菌株的分离筛选
分离纯化：采用稀释涂布法分离，在无菌条件下将红糟酸放入无菌水中，然后剧烈振摇，使微生物细胞能很好地分散于无菌水中，然后进行梯度稀释，选取适当稀释度的稀释液涂布于分离平板培养基上，28°C恒温培养3d后挑取单菌落接入斜面，待长好后继续稀释涂布分离，重复数次，直至平板中菌落形态和大小都均一，并借助光学显微镜观察，直到菌形态均一后挑取单菌落接入斜面，待长好后置于冰箱中保藏备用。
鉴定：通过菌株的形态特征、生理生化特征和 16S rRNA 分子序列分析等方法进行菌株鉴定，确定菌株的种类。
2、培养基及培养条件优化试验
通过单因素实验对培养基中的碳源、氮源进行选择和浓度确定，对培养温度、pH、培养时间进行确定。
利用正交试验对培养条件进行优化，确定最佳条件参数。 
3、菌株应用研究
将分离到的菌株用于红糟酸加工中，对其产品发酵的品质进行比较，确定不同菌株的配比效果。为红糟酸的标准化生产和工业化提供技术支持和理论依据 
红糟酸是广西桂中一带民间盛传的一种风味独特的佐餐佳品，主要集中在广西的武宣、桂平等地制作，是当地有名的土特产，因其发酵后酒糟红色味酸，食用后回味无穷而闻名。目前广西约有50家红糟酸产品的生产企业（作坊），各企业（作坊）或是执行自己制订的企业标准，或是勉强执行SB/T 10439—2007《酱腌菜》，有的甚至是无标准生产，无统一的产品质量标准，这不利于红糟酸产品生产工艺和质量控制的统一性和一致性，极大地制约了红糟酸产品的开发和市场推广。白芸等通过对广西部分红糟酸企业产品进行抽检，结果显示，红糟酸固形物含量≥60g/100 g，氨基酸态氮项目指标值≥0.08 g/100 g，食盐含量≥6 g/100 g，总酸含量≤2 g/100 g，铅、亚硝酸盐、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌指标限值与国标一致，该限值标准是合理的，镉、铬、总汞、总砷没有限量值要求。
红糟酸的品质与微生物的代谢有密切联系，例如醋酸杆菌属、片球菌属、乳酸杆菌属等，但不同地区由于制作原料及制作环境的影响，对红糟酸中的微生物种类及含量也会有一定影响，目前对不同发酵时间和不同地区产红糟酸的差异性研究比较少。李洋等通过高通量测序技术对来自武宣县的７个发酵过程样和４个成品样进行细菌和真菌多样性分析，结果表明，过程样的Chao值、Shannon指数和Simpson指数与成品样相比均有明显变化。伯克霍尔德菌（Burkholderia）和克雷伯氏菌（Klebsiella）是整个发酵过程中的优势菌，前者相对丰度在种子中可达60.97％，后者相对丰度可达36.62％。乳酸菌相对丰度在第６天大幅增加，相对丰度为14.29％；而醋酸杆菌属（Acetobacter）、克雷伯氏菌（Klebsiella）和片球菌属（Pediococcus）在成品中的相对丰度占比较高，相对丰度可达为55.88％、80.52％和25.8％；红曲霉（Monascus）是真菌中主要优势菌属，相对丰度可达98.96％。 该研究结果对红糟酸的微生物组成和演替规律提供了一定理论基础。林凤研究发现：红糟酸发酵过程中克雷伯氏菌属、 伯克霍尔德菌属及乳杆菌属是属水平上的主要微生物，具有酒香的乙醇和玫瑰香的苯乙醇是挥发性物质的主要成分。
吕健曼研究发现：基于宏基因组的红糟酸微生物多样性分析和功能菌株红曲霉筛选：对3个不同地区的红糟酸样品进行宏基因组测序分析，共检测出4 019种微生物，隶属于69门88纲191目407科1 057属。在门水平上，变形菌门(Proteobacteria)、子囊菌门(Ascomycota)、厚壁菌门(Firmicutes)为主要优势菌门，共占比70％以上。属水平上，伯克氏菌属(Burkholderia spp.)、片球菌属(Pediococcus spp.)、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、醋酸杆菌属(Acetobacter spp.)、红曲属（Monascusspp.)、青霉属(Penicillium spp.)等为优势属。种水平上，洋葱伯克霍尔德菌(B.cepacia),多噬伯克霍尔德氏菌(B.multivorans),温特曲霉(A.wentii),紫红曲霉(M.purpureus)等丰度较高。从红糟酸中分离得到9株红曲霉,并筛选出一株高产红曲色素的菌株紫红曲霉D21。
前期研究发现：伯克霍尔德菌和克雷伯氏菌在发酵过程中占比较大，醋酸杆菌属、克雷伯氏菌属和片球菌属在成品中占比较大。红曲霉菌是样本中真菌优势菌且抑制了酵母菌的生长。在红糟酸发酵过程中，发现了一些非发酵菌和致病菌，这提示在红糟酸制品中存在微生物安全性问题，应将使用无菌水，原料清洗晾晒这一环节改为无菌操作，在灌装前增加乳酸杆菌属添加步骤。红糟酸的发酵与复杂的微生物区系相关，微生物种类和区系结构对红曲制品 的产量、质量和风味起着至关重要的作用。因此，本项目通过对发酵产品中的有利菌株进行分离纯化及发酵条件优化对产品的安全性和工业化生产提供理论基础。 
由于目前国内红糟酸生产模式主要为家庭手工制作或小作坊生产，没有专业的用于发酵菌株，制作工艺亦不规范，这导致发酵成品中微生物组成情况不明，产品安全没有保障。因此，本项目通过分离纯化得出在红糟酸发酵过程中起到主要作用的菌种，并对红糟酸发酵条件进行优化，为红糟酸发酵产品的品质提供保障，促进红糟酸产品的工业化生产。
技术路线：如图1summernote-img



图1 实验技术路线



拟解决的问题：
（1） 分离筛选出红糟酸中起到主要作用的菌种，由于红糟酸发酵过程中有多种微生物起到作用，所以在分离鉴定过程中需要选取合适的样本，才能通过涂布法或者划线法获取目的菌株，而且要保证不被杂菌污染。
预期成果：
（1） 红糟酸发酵液中分离出多个纯种菌株。
（2） 探究出红糟酸发酵的最佳条件。
（3） 撰写结题报告1份，发表学术论文1篇 
2024.12-2025.1：熟悉课题，查阅文献，制定实验方案。
2025.1-2025.3：准备材料和试剂，红糟酸发酵液中菌种的分离筛选。
2025.3-2025.6：菌种的鉴定和培养基确定。
2025.6-2025.9：培养条件确定，发酵条件确定。
2025.9-2025.11：整理实验数据，分析实验结果，撰写结题报告。 
与本项目有关的研究积累和已取得的成绩
已确定红糟酸发酵液中的主要菌种。
 
化学与生物工程学院实验中心目前拥有超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、振荡培养箱、红外光谱仪、光学显微镜等设备及相应的实验材料及试剂和实验场地，能够满足项目研究的需要。

经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 5000.00 无 1800.00 3200.00
1. 业务费 3000.00 无 300.00 2700.00
（1）计算、分析、测试费 500.00 测试服 300.00 200.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 0.00 无 0.00 0.00
（4）文献检索费 0.00 无 0.00 0.00
（5）论文出版费 2500.00 发表论文 0.00 2500.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 500.00 培养器皿等小型玻璃装置 500.00 0.00
4. 材料费 1500.00 原料，试剂，培养基等 1000.00 500.00
结束

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